SARS-CoV-2 infekton limfocitet T, përmes shkrirjes së saj membranore të ndërmjetësuar nga proteina

Nature.com, 7 prill 2020 – Përktheu Arben Çokaj

Xinling Wang, Wei Xu, Gaowei Hu, Shuai Xia, Zhiping Sun, Zezhong Liu, Youhua Xie, Rong Zhang, Shibo Jiang & Lu Lu

Cellular & Molecular Immunology (2020) Citoje këtë artikull

COVID-19, sëmundja e re e koronavirus e shkaktuar nga SARS-CoV-2 dhe që shpërtheu në fund të vitit 2019 në Wuhan, Kinë¹ u bë një pandemi në mbarë botën. SARS-CoV-2 i përket gjinisë të betacoronavirus dhe ka identitet 79.5% ndaj SARS-CoV. SARS-CoV-2 përdor enzimën konvertuese të angiotenzinës 2 (ACE-2) si receptorin e saj të hyrjes te pritësi².

Manifestimet klinike të COVID-19 përfshijnë pneumoni, diarre, dispne (vështirësi në frymëmarrje) dhe dështim të shumëfishtë të organeve. Është interesante se, limfocitopenia, si një tregues diagnostik, është e zakonshme në pacientët me COVID-19. Xiong et al. gjeti një rregullim të rrugëve të apoptozës, autofagisë dhe p53 në PBMC të pacientëve me COVID-19³. Disa studime raportuan se limfocitopenia mund të jetë e lidhur me vdekshmërinë, veçanërisht në pacientët me nivele të ulëta të limfociteve T⁴,⁵ CD3⁺, CD4⁺ dhe CD8⁺. Lymfocitopenia u gjet edhe në rastet e sindromës së frymëmarrjes në Lindjen e Mesme (MERS). MERS-CoV mund të infektojë drejtpërdrejt limfocitet T primare njerëzore dhe të shkaktojë apoptozë të qelizës T përmes rrugëve apoptoze ekstrinike dhe intrinsike, por nuk mund të kopjohet te limfocitet T⁶. Sidoqoftë, është e paqartë nëse SARS-CoV-2 mund të infektojë edhe qelizat T, duke rezultuar në limfocitopeni.

Për të adresuar këtë pyetje, ne vlerësuam ndjeshmërinë e limfociteve T ndaj infeksionit SARS-CoV-2. Për ta realizuar këtë, SARS-CoV dhe SARS-CoV-2 të pseudotipizuara u paketuan bazuar në metodat e përshkruara më parë.⁷ Pseudoviruset mund të infektonin qelizat lejuese (qelizat 293T / ACE2 dhe Huh7) duke shprehur receptorin ACE2, por nuk mund të infektonin qelizat jo-pezmuese (qelizat HeLa) (Fig. 1a). Ne përdorëm pseudovirus me infektivitet të barabartë me qelizat 293T / ACE2 (Fig. 1c) për të infektuar dy linja qelizash limfocitare T, MT-2 dhe A3.01, me një nivel shumë të ulët, ose afër nivelit të shprehur të mRNA të hACE2 (Fig. 1b ). Çuditërisht, mbi disa përsëritje, ne pamë se linjat e qelizave T ishin dukshëm më të ndjeshme ndaj infeksionit SARS-CoV-2, kur u krahasuan me SARS-CoV (Fig. 1c).

Me fjalë të tjera, këto rezultate na tregojnë se limfocitet T mund të jenë më lejuese ndaj infeksionit SARS-CoV-2 dhe më pak lejues për infeksionin SARS-CoV, të ngjashme me gjetjet në një studim të mëparshëm.⁶ Prandaj, është e pranueshme, që proteina S e SARS-CoV-2 mund të ndërmjetësojë infektivitetin e fuqishëm, madje edhe në qelizat që shprehin hACE2 të ulët, gjë që, nga ana tjetër, do të shpjegojë pse shkalla e transmetimit të SARS-CoV-2 është kaq e lartë. Është gjithashtu e mundur, që receptorët e tjerë të ndërmjetësojnë hyrjen e SARS-CoV-2 në qelizat T, siç është CD147, të pranishëm në sipërfaqen e limfociteve T⁸, i cili kohët e fundit u raportua se ishte një rrugë e re pushtuese për SARS-CoV-2.⁹

Fig. 1
Nga: SARS-CoV-2 infekton limfocitet T, përmes shkrirjes së saj membranore të ndërmjetësuar nga proteina.

Ndjeshmëria e limfociteve T ndaj infeksionit SARS-CoV-2.
a. infeksion i pseudotipizuar SARS-CoV-2 dhe SARS-CoV. 293T / ACE2 dhe Huh7 janë qeliza lejuese, ndërsa HeLa është një linjë qelizore jopermeruese.
b. Shprehja e ACE2 mRNA në qelizat T. Qelizat 293T / ACE2 të përdorura si një kontroll.
c. Infeksioni i pseudotipizuar SARS-CoV-2 dhe SARS-CoV në linjat qelizore limfoide T.
d. Pengimi i peptidit EK1 në pseudotipet SARS-CoV-2 në qelizat MT-2.
e. Shkrirja e S-qeliza-qeliza-ndërmjetësuar nga SARS-CoV-2 në qelizat MT-2. Qelizat MT-2 u kokulturën me qelizat 293T / SARS-CoV-2 / EGFP. Bashkimi qelizë-qelizë u fotografua nën një mikroskop optik me fluoreshencë ose dritë të dukshme. Qelizat e shkrira tregohen me një shigjetë të bardhë. Shiriti mee shkallësh 800 μm.
f. Zbulimi i qelizave SARS-CoV-2 NP-pozitive me citometri të rrjedhës. Qelizat MT-2 u infektuan me SARS-CoV-2 në 1TCID50 për qelizë, përkatësisht. Qelizat u fiksuan dhe u permeabilizuan në 24 dhe 48 orë pas infeksionit dhe imunoloheshin për zbulimin e SARS-CoV-2 NP.
g. Infeksioni i qelizave MT-2 nga SARS-CoV-2 është abortiv. Qelizat u inokuluan me SARS-CoV-2 në 1TCID50 për qelizë dhe u kultivuan në 1, 6, 24 dhe 48 orë pas infeksionit.Lizat e qelizave (lart) dhe pluskues (më poshtë) u mblodhën për të zbuluar gjenin viral N me RT-qPCR. Në panele, shirita dhe shiritat e gabimit përfaqësohen mjetet dhe devijimet standarde. Analizat statistikore janë kryer duke përdorur testin t të pa-bashkuar. *p < 0.05

Për të vlerësuar nëse SARS-CoV-2 hyn në limfocitet T, përmes endocitozës pa ndërmjetësues, ne kemi përdorur peptidin EK1, i cili ka treguar se frenon proteinën spike të SARS-CoV-2 (S), me ndërmjetësim qeliz-qelizë dhe infeksion pseudovirus⁷,¹⁰. Në mënyrë të veçantë, ajo pengon infeksionin e ndërmjetësuar nga receptori duke bashkëvepruar me HR1 për të bllokuar formimin e tufës me gjashtë helika (6-HB), duke penguar më tej bashkimin midis membranave virale dhe qelizave të synuara. Ne zbuluam se peptidi EK1 kishte aktivitet të rëndësishëm frenues ndaj pseudoviruseve SARS-CoV-2 në qelizat MT-2 (Fig. 1d), duke sugjeruar që hyrja e virusit varet nga shkrirja e ndërmjetësuar nga receptori. Sidoqoftë, vetëm një përqendrim i lartë (40 μM) i EK1 kishte aktivitet frenues në qelizat MT-2. Ndërkohë, vlera IC50 e EK1 ishte 2.38 μM në qelizat 293T / ACE-2¹⁰.

Këto rezultate sugjerojnë që SARS-CoV-2 gjithashtu mund të hyjë në limfocitet T përmes rrugës endocitoze të ndërmjetësuar nga receptori. Për ta sqaruar këtë, ne kemi kryer një analizë të bashkimit qelizë-qelizë të ndërmjetësuar nga SARS-CoV-S sipas studimeve të mëparshme⁷,¹⁰. Pas 48 h të kulturës, qelizat 293T shprehin proteinën SARS-CoV-2 S të shkrirë me qelizat MT-2. Krahasuar me qelizat e pashfrytëzuara, qelizat e bashkuara grumbullohen së bashku dhe shfaqen si një masë e madhe e gjelbër e zbehtë fluoreshente. Në të kundërt, asnjë qelizë e shkrirë nuk u gjet në kokturën SARS-CoV (Fig. 1e). Prandaj, mund të konkludohet se SARS-CoV-2 mund të infektojë qelizat T, përmes shkrirjes së membranës së ndërmjetësuar nga proteina S.

Për ta përcaktuar më tej ndjeshmërinë e qelizave MT-2 ndaj virusit të gjallë, ne kemi përdorur SARS-CoV-2 për të infektuar qelizat MT-2 dhe zbuluam nukleoproteinën SARS-CoV-2 (NP) në qeliza, siç është raportuar më parë.⁶ Në mënyrë të veçantë, disa qeliza MT-2 u infektuan me SARS-CoV-2 (Fig. 1f). Në mënyrë sasiore, përqindja e qelizave të SARS-CoV-2 NP-pozitive MT-2 ishte 23.11% më e lartë se ajo e qelizave të pa infektuara në 24 orë pas infeksionit, që është rreth 4.6-fish i pjesës në 1 orë (Fig. 1f). Ky rezultat do të thotë që virusi depërtoi në qelizat MT-2 në 24 orë dhe i infektoi ato.

Duke pasur parasysh që MERS-CoV mund të infektojë në mënyrë efikase, por jo të përsëritur, në limfocitet T,⁶ ne zbuluam më tej numrin e kopjeve të gjenomit viral në pika të ndryshme kohore pas infeksionit për të eksploruar karakteristikat e përsëritjes së SARS-CoV-2 në qelizat MT-2. Ngjashëm me MERS-CoV, SARS-CoV-2 nuk arriti të përsëritet në qelizat MT-2 (Fig. 1g). Numri i kopjeve të gjenomit viral në 6 orë ishte dukshëm më i lartë se sa pikat e tjera kohore në lizatin qelizor, por gjithnjë mbeti i qëndrueshëm në të gjitha pikat e kohës në supernatantë. Këto rezultate sugjerojnë që SARS-CoV-2 mund të hyjë në qelizat MT-2 në infeksionin pas 6 orësh, por nuk përsëritet, dhe më pas degradohet ARN-ja virale. Në supernatantë, kopjet virale të zbuluara mund të jenë sfondi i virioneve të mbetura, të ngjashme me rezultatet e studimit të mëparshëm MERS-CoV (Fig. 1g).⁶

Bazuar në rezultatet e pseudovirusit dhe infeksionit të virusit të gjallë, këtu kemi vërtetuar se (1) SARS-CoV-2 mund të infektojë qelizat T, (2) qelizat T të infektuara nga SARS-CoV-2 përmes qelizave T të infektuara nga receptori, S, me ndërmjetësim të proteinave, dhe (3) infeksioni mund të pengohet nga peptidi EK1. Sidoqoftë, kemi vërejtur një nivel shumë të ulët të shprehjes së hACE2 në qelizat T; Prandaj, ne propozuam më tej, që një receptor i ri të ndërmjetësonte hyrjen SARS-CoV-2 në qelizat T. Ngjashëm me MERS-CoV, infeksioni i SARS-CoV-2 i qelizave T është abortiv. Një studim i fundit raportoi se leximet virale mezi shfaqen në mostrat PBMC nga pacientët COVID-19 përmes sekuencave transkriptome të ARN-ve. Kështu, është konstatuar se SARS-CoV-2 nuk mund të infektojë PBMC. Sidoqoftë, karakteristikat transkriptomike të PBMC, u zbuluan dhe u analizuan nga tre pacientë. Dy lexime SARS-CoV-2 u zbuluan në PBMC të një pacienti, dhe zero lexime në një tjetër.³

Ky rezultat mund t’i atribuohet replikimit joproduktiv të SARS-CoV-2 në limfocitet T, me gjenom të vogël viral në PBMCs ndoshta degraduese në mostër, procesi i mbledhjes dhe nxjerrjes së ARN-së. Kështu që, pyetjet e infeksionit SARS-CoV-2 dhe replikimit në qelizat T primare dhe nëse infeksioni shkakton apoptozë në qelizat T ende kanë nevojë për hulumtime të mëtejshme, duke evokuar potencialisht ide të reja në lidhje me mekanizmat patogjenë dhe ndërhyrjet terapeutike.

REFERENCAT
1.
Jiang, S. et al. Një emër i veçantë është i nevojshëm për koronavirusin e ri. Lancet https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30419-0 (2020).

2.
Zhou, P. et al. Një shpërthim i pneumonisë i shoqëruar me një koronavirus të ri me origjinë të mundshme nga lakuriqi. Natyra 579, 270–273 (2020). CAS | Article | Google Scholar

3.
Xiong, Y. et al. Karakteristikat transkriptomike të lëngut të lavazhit bronkoalveolar dhe qelizave mononukleare të gjakut periferik në pacientët me COVID-19. https://doi.org/10.2139/ssrn.3549993 (2020).

4.
Zeng, Q. et al. Vdekshmëria e COVID-19 është e lidhur me funksionin imunitar qelizor, në krahasim me funksionin imunitar në popullatën kineze Han (2020). Paraprakisht në https://doi.org/10.1101/2020.03.08.20031229 (2020).

5.
Zheng, M. et al. Shterimi funksional i limfociteve antivirale te pacientët me COVID-19. Cell. Mol. Immunol. https://doi.org/10.1038/s41423-020-0402-2 (2020).

6.
Chu, H. et al. Koronavirusi i sindromës së frymëmarrjes në Lindjen e Mesme, në mënyrë efikase infekton limfocitet T primare të njeriut dhe aktivizon rrugët e apoptozës ekstrinsike dhe intrinsike. J. Infekt. Dis. 213, 904–914 (2016). CAS | Article | Google Scholar

7.
Xia, S. et al. Një frenues i bashkimit pan-koronavirus, që synon fushën HR1 të njollave të koronavirusit njerëzor. Sci. Adv. 5, eaav4580 (2019). CAS | Article | Google Scholar

8.
Koch, C. et al. Epitopet e aktivizuara të qelizave T të CD147 në rregullimin e përgjigjes së qelizës T, dhe përcaktimin e tyre nga afiniteti i antitrupave dhe densiteti i antigjenit. Int. Immunol. 11, 777–786 (1999). CAS | Article | Google Scholar

9.
Wang, K. et al. SARS-CoV-2 pushton qelizat pritëse, përmes një rruge të re: proteina spike e CD147. Publikuar në https://doi.org/10.1101/2020.03.14.988345 (2020).

10.
Xia, S. et al. Inhibicioni i infeksionit SARS-CoV-2 (më parë 2019-nCoV) nga një frenues shumë i fuqishëm i bashkimit pan-koronavirus, duke synuar proteinën e tij pikante, që përmban një kapacitet të lartë, për të ndërmjetësuar shkrirjen e membranës. Res Res. https://doi.org/10.1038/s41422-020-0305-x (2020).